免疫組化實(shí)驗(yàn)操作方法
    免疫組化是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑 (熒光素、酶、金屬離子、同位素) 顯色來(lái)確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原 (多肽和蛋白質(zhì))，對(duì)其進(jìn)行定位、定性及定量的研究。根據(jù)標(biāo)記物的不同分為：免疫酶法、免疫熒光法、親和組織化學(xué)法、免疫鐵蛋白法、免疫金法及放射免疫自影法等。其中前三種最常用。

免疫組化實(shí)驗(yàn)操作方法-即用型(Envision)快速酶免疫組化二步法
實(shí)驗(yàn)方法原理 根據(jù)聚合酶技術(shù)把辣根過(guò)氧化物酶抗鼠或/和抗兔IgG分子結(jié)合在多聚酶上形成多聚物分子,其與待檢的抗原特異性的結(jié)合后，加入底物顯色。
實(shí)驗(yàn)材料 石蠟切
試劑、試劑盒 PBS檸檬酸鹽緩沖液蒸餾水增強(qiáng)劑酶標(biāo)抗鼠 兔聚合物蘇木素酒精二甲苯樹(shù)膠鹽酸二氨基聯(lián)苯胺
儀器、耗材 烘箱微波盒塑料切片架顯微鏡膠頭滴管
抗體 小鼠CDC2單克隆抗體
IgG1, κ抗體
IgG1, κ抗體
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 石蠟切片置于67℃烘箱中，烘片2小時(shí)，脫蠟至水，用pH7.4的PBS沖洗三次，每次3分鐘（3×3’）。

2. 取一定量pH=6.0檸檬酸鹽緩沖液，加入微波盒中，微波加熱至沸騰，將脫蠟水化后的組織切片置于耐高溫塑料切片架上，放入已沸騰的緩沖液中，中檔微波處理10分鐘，取出微波盒流水自然泠卻，從緩沖液中取出玻片，先用蒸餾水沖洗兩次，之后用PBS沖洗2×3’。（注：不是所有的抗體都需要微波修復(fù)的，視具體情況而定）

3. 每張切片加1滴3%H2O2，室溫下孵育10分鐘，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。PBS沖洗3×3’。

4. 除去PBS液，每張切片加1滴相應(yīng)的第一抗體（相應(yīng)稀釋倍數(shù)），室溫下孵育2小時(shí)。

5. PBS沖洗3×5’。除去PBS液，每張切片加1滴聚合物增強(qiáng)劑，室溫下孵育20分鐘。PBS沖洗3×3’。

6. 除去PBS液，每張切片加1滴酶標(biāo)抗鼠/兔聚合物，室溫下孵育30分鐘。PBS沖洗3×5’。

7. 除去PBS液，每張切片加1滴新鮮配制的DAB液（二氨基聯(lián)苯胺），顯微鏡下觀(guān)察5分鐘。

8. 蘇木素復(fù)染，0.1%HCl分化，自來(lái)水沖洗，藍(lán)化，切片經(jīng)梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固，晾干后觀(guān)察。
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其他
一、特點(diǎn)

1. 在切片加上一抗后，第二抗體標(biāo)記多聚螯合物酶（HRP）的復(fù)合物與一抗結(jié)合，在多聚螯合物上有大量的HRP分子，使抗原信號(hào)有顯著的放大，其敏感性較SABC、SP法高。

2. 由于多聚物在體內(nèi)不存在，又不使用生物素，從而避免了由于生物素引起的非特異性背景染色，背景比SABC、SP法清晰。

3. 辣根過(guò)氧化物酶與二抗結(jié)合在多聚物上，替代傳統(tǒng)方法的 二抗、三抗，減少了實(shí)驗(yàn)步驟，且試劑孵育時(shí)間短，只需15分鐘，使得免疫組化方法更簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)時(shí)間比SABC、SP法大為縮短。

免疫組化實(shí)驗(yàn)操作方法-鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連結(jié)SP法
實(shí)驗(yàn)方法原理
SP（streptavidin-perosidase）法，即鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連結(jié)法。SP法是最常使用的方法。
試劑、試劑盒 二甲苯酒精PBS雙氧水枸櫞酸緩沖液羊血清工作液辣根過(guò)氧化物酶鏈霉素卵白素蘇木素DAB
儀器、耗材 冰箱顯微鏡燒杯玻璃缸
抗體 小鼠CDC2單克隆抗體
IgG1, κ抗體
IgG1, κ抗體
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 烤片：68℃，20 min。

2. 常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水：二甲苯I 20 min⇒二甲苯II 20 min⇒00%酒精10 min⇒100%酒精10 min⇒95%酒精5 min⇒80%酒精5 min⇒70%酒精5 min。

3. 阻斷滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶：3%H2O2 37℃孵育10 min，PBS沖洗3X5 min。

4. 抗原修復(fù)：置0.01 M枸櫞酸緩沖液（PH6.0）中用煮沸（95℃，15-20 min），自然冷卻20 min以上，再用冷水沖洗缸子，加快冷卻至室溫，PBS沖洗3X5 min。

5. 正常羊血清工作液封閉，37℃10 min，傾去勿洗。

6. 滴加一抗4℃冰箱孵育過(guò)夜，PBS沖洗3X5 min（用PBS緩沖液代替一抗作陰性對(duì)照）；滴加生物素標(biāo)記二抗，37℃孵育30 min，PBS沖洗3X5 min。

7. 滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液，37℃孵育30 min，PBS沖洗3X5 min。

8. DAB/H2O2反應(yīng)染色，自來(lái)水充分沖洗后，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，干燥，封片。

免疫組化實(shí)驗(yàn)操作方法-卵白素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物（ABC）法
實(shí)驗(yàn)材料 蠟塊切片
試劑、試劑盒 多聚甲醛蒸餾水蔗糖過(guò)氧化氫甲醇PBS酒精KPBS牛血清白蛋白疊氮納一抗二抗
儀器、耗材 冰箱顯微鏡燒杯
抗體 小鼠CDC2單克隆抗體
IgG1, κ抗體
IgG1, κ抗體
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 4%多聚甲醛常規(guī)灌注固定，取材并置20%蔗糖溶液（4℃）中過(guò)夜。蠟塊制作。切片，貼片。0.01 M KPBS清洗5 min×3后；

2. 加入配好的0.3%的過(guò)氧化氫甲醇溶液（甲醇80 ml+0.01 M KPBS 100 ml+30%過(guò)氧化氫）30 min，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的影響，0.01 M PBS清洗5 min×3；

3. 加入配好的0.3% Triton X100（30% Triton X100+0.01 M KPBS 100 ml）30 min，以增加細(xì)胞的通透性，0.01 M KPBS清洗5 min×3；

4. 加入用血清稀釋液（牛血清白蛋白1.00 g+0.01 M PBS 100 ml+疊氮納0.08 g）稀釋的一抗，4℃存放24-48 h；吸去抗體，0.01 M KPBS洗5 min×3；

5. 加入0.01 M KPBS稀釋的的二抗，室溫孵育2 h。0.01 M KPBS洗5 min×3；

6. 加入ABC復(fù)合物之類(lèi)的抗體，室溫孵育2 h，0.01 M KPBS洗5 min×3；蒸餾水迅速?zèng)_三次；

7. 加入顯色液，進(jìn)行免疫組織化學(xué)顯色，時(shí)間一般不超過(guò)30 min，可不時(shí)在顯微鏡下進(jìn)行觀(guān)察，待細(xì)胞著色而背底顏色較淡時(shí)馬上吸去顯色液，用蒸餾水迅速?zèng)_三次后加入0.01 M KPBS終止反應(yīng)；

8. 梯度酒精脫水之后，封片，拍照。

免疫組化實(shí)驗(yàn)操作方法-鏈霉親和素—生物素—過(guò)氧化物酶復(fù)合物（SABC）法
實(shí)驗(yàn)方法原理
SABC(Strept Avidin-Biotin Complex)法是一種顯示組織和細(xì)胞中抗原分布的簡(jiǎn)便而敏感的免疫組化染色方法，是眾多免疫組織化學(xué)方法的一種。SABC法：一抗+ 生物素標(biāo)記二抗+ 滴加試劑SABC（鏈霉卵白素+ 辣根酶標(biāo)記生物素）+ 辣根酶底物顯色。目前常用的親和素從鏈霉菌(streptomyces)培養(yǎng)物中提取，因此稱(chēng)為鏈霉親和素—生物素—過(guò)氧化物酶復(fù)合物技術(shù)(streptavidin biotin-peroxidase complex method，SABC法)。

生物素(biotin)為含硫的雜環(huán)單羧酸，分子量小，通過(guò)其羧基與蛋白質(zhì)的氨基結(jié)合，從而可標(biāo)記抗體和酶。親和素(avidin)又稱(chēng)抗生物素蛋白，是一種糖蛋白，在雞蛋白中被發(fā)現(xiàn)，分子量為68 000。生物素與親和素有很高的親和力，1個(gè)親和素分子上有4個(gè)生物素結(jié)合位點(diǎn)。在ABC法中，不對(duì)特異性第一抗體進(jìn)行標(biāo)記，而用生物素標(biāo)記第二抗體，染色前按一定比例將親和素與生物素標(biāo)記的過(guò)氧化物酶混合，制成ABC合物，并使親和素分子上至少空出1個(gè)生物素結(jié)合位點(diǎn)。染色時(shí)，標(biāo)本中的抗原先與第一抗體結(jié)合，后者再與生物素標(biāo)記的第二抗體結(jié)合，然后加入ABC復(fù)合物，結(jié)合到第二抗體的生物素上，最終形成的復(fù)合物網(wǎng)絡(luò)了大量的酶分子。因此，敏感性更高。
抗體 小鼠CDC2單克隆抗體
IgG1, κ抗體
IgG1, κ抗體
實(shí)驗(yàn)步驟
一、洗載玻片

1. 將載玻片置于重鉻酸鉀和濃H2SO4混合液中，目的是為了是載玻片上的硅膠等除去，同時(shí)使一些肉眼看不見(jiàn)的凹凸不平的表面變平整，便于組織吸附。

2. 置于清水中清洗，除去殘余的重鉻酸鉀和濃H2SO4（大約沖一個(gè)小時(shí)左右）。

3. 將載玻片浸泡于酒精之中， 然后放到架子上，置于37℃溫箱中，將多聚賴(lài)氨酸涂布于玻片的表面，由于Lys帶正電，而大多數(shù)的組織帶負(fù)電荷，從而產(chǎn)生吸附作用。

二、包埋組織

1. 在鐵模具中加入一些液態(tài)石蠟，先稍微冷卻，然后再將待包埋的組織置于石蠟之中，并排列整齊。

2. 將塑料模具盒蓋上，最后加入少許液體石蠟，進(jìn)行冷凍，使石蠟變成固態(tài)。

三、切片

1. 將包埋好的組織從模具上取下來(lái)，并置于石蠟切片機(jī)上，切片機(jī)通過(guò)調(diào)節(jié)上下左右來(lái)來(lái)使組織和切割方向一致。

2. 調(diào)節(jié)切片的厚度，一般為5 um，如果比較難切，則可以適當(dāng)調(diào)整厚度，用毛筆將切割的載玻片向外拉，并用小鑷子將包含有完整組織的載玻片置于40 ℃溫水中。

四、撈組織

當(dāng)組織載玻片置于40 ℃溫水中之前，要先將水浴中的氣泡趕走，以免氣泡受熱上浮而貼到組織上，組織受熱展開(kāi)，最好是組織不起皺紋，用載玻片撈組織時(shí)，一般取載玻片的下1/3或者下1/2一般每種組織撈5-6張，其中2-3張是備用的，每張載玻片上通常撈兩份組織，做對(duì)照使用，這樣形成的誤差就比較小了，而且撈載玻片的時(shí)候最好方向一致，以便觀(guān)察，再將撈出來(lái)的載玻片置于架子上，放入37 ℃溫箱中烘干。

五、脫蠟

依次將載玻片放入二甲苯-二甲苯-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精，起脫蠟作用的主要是二甲苯，依據(jù)的是相似相溶的原理。一般在每個(gè)試劑中放10 min，天氣熱可以少放幾分鐘，相反，天氣較冷的話(huà)就要適當(dāng)延長(zhǎng)脫蠟時(shí)間，一般為12-15 min。

六、抗原修復(fù)

脫蠟后在清水中沖洗一段時(shí)間，加入3%H2O2浸泡10 min，從而除去內(nèi)源性的過(guò)氧化氫酶，然后倒掉H2O2，在清水中洗兩次，再加入檸檬酸緩沖液，放入微波爐中蒸煮3 min（中火），一般剛到沸騰即可，冷卻至室溫，然后再蒸煮一次，冷卻至室溫，蒸煮的目的是為了使抗原的位點(diǎn)暴露出來(lái)。

七、血清封閉

冷卻至室溫后，將檸檬酸緩沖液倒掉，水洗2次，并將載玻片置于PBS中5 min，洗2次，擦干組織周?chē)�的PBS液，馬上加上血清，使一些非特異性的位點(diǎn)封閉起來(lái)，然后放入37 ℃溫箱中半小時(shí)。血清稀釋10倍（900 ul PBS：100 ul血清封閉液）。

八、加一抗

將溫箱中的載玻片取出，用吸水紙擦干載玻片反面和正面組織周?chē)�的血清，加一抗，如果做�?duì)照實(shí)驗(yàn)，就在對(duì)照的組織上加PBS。加完一抗后于4℃冰箱中保存過(guò)夜。


九、加二抗

將載玻片從冰箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干組織周?chē)�的PBS后加上二抗，然后置于37℃溫箱中半小時(shí)。

十、加SABC

將片子從溫箱中取出, 放入PBS中洗3次，每次5min，擦干組織周?chē)�的PBS后加上SABC， 然后置于37℃溫箱中半小時(shí)。SABC稀釋100倍（990ul PBS：10ul SABC）。


十一、加顯色劑

將片子從溫箱中取出, 放入PBS中洗3次，每次5min，擦干組織周?chē)�的PBS后加上顯色劑。（顯色劑的配置：在1ml水中加1滴顯色劑A，搖勻，然后加1滴顯色劑B，搖勻，再加1滴顯色劑C，搖勻） A：DAB B：H2O2 C：磷酸緩沖液

十二、復(fù)染

將顯色后的片子用清水沖洗一段時(shí)間后，浸泡于蘇木精中染色，一般動(dòng)物組織為半分鐘，植物組織3-5min。

十三、脫水

將復(fù)染后的片子置于水中沖洗后，依次將載玻片放入70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-100%酒精-100%酒精-二甲苯-二甲苯。每個(gè)試劑中放置2min，最后浸泡在二甲苯中，搬到通風(fēng)柜中。

十四、封片

用中性樹(shù)膠滴在組織旁邊，再用蓋玻片蓋上，要先放平一側(cè)，然后輕輕放下另一側(cè)，以免產(chǎn)生氣泡，封好片子后置于通風(fēng)柜中晾干。