一、實驗目的
1、掌屋凋亡細胞的形態(tài)特征
2、學會用熒光探針對細胞進行雙標記來檢測正�；罴毎�、凋亡細胞和壞死細胞的方法

二、實驗原理

細胞死亡根據(jù)其性質(zhì)、起源及生物學意義區(qū)分為凋亡和壞死兩種不同類型。凋亡普遍存在于生命界，在生物個體和生存中起著非常重要的作用。它是細胞在一定生理條件下一系列順序發(fā)生事件的組合，是細胞遵循一定規(guī)律自己結(jié)束生命的自主控制過程。細胞凋亡具有可鑒別的形態(tài)學和生物化學特征。

在形態(tài)上可見凋亡細胞與周圍細胞脫離接觸，細胞變園，細胞膜向內(nèi)皺縮、胞漿濃縮、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張、細胞核固縮破裂呈團塊狀或新月狀分布、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細胞膜進一步融合將細胞分成多個完整包裹的凋亡小體，凋亡小體最后被吞噬細胞吞噬消化。在凋亡過程中細胞內(nèi)容物并不釋放到細胞外，不會影響其它細胞，因而不引起炎癥反應。

在生物化學上，多數(shù)細胞凋亡的過程中，內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶活化，活性增加。核DNA隨機地在核小體的連接部位被酶切斷，降解為180-200bp或它的整倍數(shù)的各種片斷。如果對核DNA進行瓊脂糖電泳，可顯示以180-200bp為基數(shù)的DNA ladder（梯狀帶紋）的特征。

相比之下，壞死是細胞處于劇烈損傷條件下發(fā)生的細胞死亡。細胞在壞死早期即喪失質(zhì)膜完整性，各種細胞器膨脹，進而質(zhì)膜崩解釋放出其中的內(nèi)容物，引起炎癥反應，壞死過程中細胞核DNA雖也降解，但由于存在各種長度不等的DNA片斷，不能形成梯狀帶紋，而呈彌散狀。

一些溫和的損傷刺激及一些抗腫瘤藥物可誘導細胞凋亡，通常這些因素在誘導凋亡的同時，也可產(chǎn)生細胞壞死，這取決于損傷的劇烈程度和細胞本身對刺激的敏感程度。

熒光探針雙標記法
實驗方法原理
本實驗用1μg/ml 三尖杉酯堿HT在體外誘導培養(yǎng)的HL-60細胞發(fā)生凋亡，同時也有少數(shù)細胞發(fā)生壞死。用Hoechst33342和碘化丙啶（propidium iodide，PI）對細胞進行雙重染色，可以區(qū)別凋亡、壞死及正常細胞。

三尖杉酯堿（HT）是我國自行研制的一種對急性粒細胞白血病，急性單核白血病等有良好療效的抗腫瘤藥物。研究表明HT在0.02~5μg/ml范圍內(nèi)作用2小時，即可誘導HL-60細胞凋亡，并表現(xiàn)出典型的凋亡特征。

細胞膜是一選擇性的生物膜，一般的生物染料如PI等不能穿過質(zhì)膜。當細胞壞死時，質(zhì)膜不完整，PI就進入細胞內(nèi)部，它可嵌入到DNA或RNA中，使壞死細胞著色，凋亡細胞和活細胞不著色。而一些活細胞染料由于為親脂性物質(zhì)，可跨膜進入活細胞，因而可進行活細胞染色。Hoechst33342是一種活性熒光染料且毒性較弱，它是雙苯并咪唑的一種衍生物。與DNA特異結(jié)合（主要結(jié)合于A-T）堿基區(qū)），顯示凋亡細胞和活細胞。凡是看到有凋亡小體的細胞都是凋亡細胞。
實驗材料 人早幼粒白血病HL-60細胞
試劑、試劑盒 三尖杉酯堿Tris-HclEDTA緩沖液堿性裂解液SDS醋酸鈉異丙醇乙醇溴酚藍蔗糖指示劑TBE電泳緩沖液瓊脂糖溴乙錠PI母液Ho33342母液
儀器、耗材 熒光顯微鏡電泳儀電泳槽微量加樣器離心管載玻片蓋玻片
實驗步驟
一、試劑準備

1. 三尖杉酯堿（HT）：300μg/ml；

2. Tris-HCl（pH7.5）：100mmol/L；

3. EDTA緩沖液：5mol/L；

4. 堿性裂解液：0.2mol/L NaOH；

5. 醋酸鈉：3mol/L KAc（pH4.8）；

6. PI母液：500μg/ml；

7. Ho33342母液：2mmol/L；

8. 人早幼粒白血病HL-60細胞：用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基在37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)。

9. 其他：異丙醇、1%SDS、70%乙醇、溴酚藍、蔗糖指示劑、TBE電泳緩沖液、1%瓊脂糖、溴乙錠。


二、三尖杉酯堿誘發(fā)HL-60細胞凋亡

1. 實驗前約24小時，接種兩瓶HL-60細胞，標記①、②，每瓶含約6 ml培養(yǎng)液，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

2. 實驗前約2.5小時，當細胞密度達到70%，①號瓶加入三尖杉酯堿200 μl，使終濃度為1 μg/ml，②號瓶中加入同等量PBS（pH7.4）作對照。共同放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2.5小時。

3. Ho33342和PI雙重染色鑒別三種細胞

（1）染色：將瓶中的細胞搖勻取200 μl于1.5 ml的離心管中，加入Ho33342母液2 μl，PI 20 μl，染色15分鐘。

（2）滴片：取一載玻片用雙面膠圍成一小室，從離心管中各取以上染色后的細胞懸液10 μl，加入小室內(nèi)蓋上蓋玻片，熒光鏡下用紫外激發(fā)光，高倍鏡下觀察，區(qū)別三種細胞，并注意三者比例。

注意事項

1. 誘導培養(yǎng)HL-60細胞時間要準確；

2. 熒光顯微鏡下觀察細胞時，由于熒光易碎滅，觀察時要盡量快。
其他
細胞死亡根據(jù)其性質(zhì)、起源及生物學意義區(qū)分為凋亡和壞死兩種不同類型。凋亡普遍存在于生命界，在生物個體和生存中起著非常重要的作用。它是細胞在一定生理條件下一系列順序發(fā)生事件的組合，是細胞遵循一定規(guī)律自己結(jié)束生命的自主控制過程。細胞凋亡具有可鑒別的形態(tài)學和生物化學特征。

在形態(tài)上可見凋亡細胞與周圍細胞脫離接觸，細胞變園，細胞膜向內(nèi)皺縮、胞漿濃縮、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張、細胞核固縮破裂呈團塊狀或新月狀分布、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細胞膜進一步融合將細胞分成多個完整包裹的凋亡小體，凋亡小體最后被吞噬細胞吞噬消化。在凋亡過程中細胞內(nèi)容物并不釋放到細胞外，不會影響其它細胞，因而不引起炎癥反應。

在生物化學上，多數(shù)細胞凋亡的過程中，內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶活化，活性增加。核DNA隨機地在核小體的連接部位被酶切斷，降解為180-200bp或它的整倍數(shù)的各種片斷。如果對核DNA進行瓊脂糖電泳，可顯示以180-200bp為基數(shù)的DNA ladder（梯狀帶紋）的特征。

相比之下，壞死是細胞處于劇烈損傷條件下發(fā)生的細胞死亡。細胞在壞死早期即喪失質(zhì)膜完整性，各種細胞器膨脹，進而質(zhì)膜崩解釋放出其中的內(nèi)容物，引起炎癥反應，壞死過程中細胞核DNA雖也降解，但由于存在各種長度不等的DNA片斷，不能形成梯狀帶紋，而呈彌散狀。

一些溫和的損傷刺激及一些抗腫瘤藥物可誘導細胞凋亡，通常這些因素在誘導凋亡的同時，也可產(chǎn)生細胞壞死，這取決于損傷的劇烈程度和細胞本身對刺激的敏感程度。

形態(tài)學檢測法
實驗方法原理 根據(jù)凋亡細胞固有的形態(tài)特征，使用合適的顯微鏡檢測凋亡細胞形態(tài)變化。
實驗材料 Hela細胞Jurkat細胞
試劑、試劑盒 DAPIHoechst蒸餾水PBS
儀器、耗材 光學顯微鏡倒置顯微鏡透射電子顯微鏡熒光顯微鏡共聚焦激光掃描顯微鏡
實驗步驟
一、光學顯微鏡和倒置顯微鏡

1. 未染色細胞：凋亡細胞的體積變小、變形，細胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，細胞凋亡晚期可見凋亡小體。

貼壁細胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落。

2. 染色細胞：常用姬姆薩染色、瑞氏染色等。凋亡細胞的染色質(zhì)濃縮、邊緣化，核膜裂解、染色質(zhì)分割

成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)。

二、 熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡

一般以細胞核染色質(zhì)的形態(tài)學改變?yōu)橹笜藖碓u判細胞凋亡的進展情況。

常用的DNA特異性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258)，DAPI。三種種染料與DNA的結(jié)合是非嵌入式的，主要結(jié)合在DNA的A-T堿基區(qū)。紫外光激發(fā)時發(fā)射明亮的藍色熒光。

Hoechst是與DNA特異結(jié)合的活性染料，儲存液用蒸餾水配成1 mg/ml的濃度，使用時用PBS稀釋，終濃度為10 ug/ml。

DAPI為半通透性，用于常規(guī)固定細胞的染色。儲存液用蒸餾水配成1 mg/ml的濃度，使用終濃度一般為10 ug/ml。

結(jié)果評判：細胞凋亡過程中細胞核染色質(zhì)的形態(tài)學改變分為三期：Ⅰ期的細胞核呈波紋狀（rippled）或呈折縫樣（creased），部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài)；Ⅱa期細胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；Ⅱb期的細胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體(圖1)。

三、 透射電子顯微鏡觀察

結(jié)果評判：凋亡細胞體積變小，細胞質(zhì)濃縮。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的細胞核內(nèi)染色質(zhì)高度盤繞，出現(xiàn)許多稱為氣穴現(xiàn)象（cavitations）的空泡結(jié)構(gòu)(圖2)；Ⅱa期細胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；細胞凋亡的晚期，細胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。