原核表達實驗技術(shù)服務(wù)

點擊次數(shù)：2467 日期：2013/11/16 10:37:21

一、原核表達實驗原理
1、E . coli表達系統(tǒng)
E . coli是重要的原核表達體系。在重組基因轉(zhuǎn)化入E . coli 菌株以后，通過溫度的控制，誘導(dǎo)其在宿主菌內(nèi)表達目的蛋白質(zhì)，將表達樣品進行SDS-PAGE 以檢測表達蛋白質(zhì)。
2、外源基因的誘導(dǎo)表達
提高外源基因表達水平的基本手段之一，就是將宿主菌的生長與外源基因的表達分成兩個階段，以減輕宿主菌的負荷。常用的有溫度誘導(dǎo)和藥物誘導(dǎo)。本實驗采用異丙基硫代-β-D-半乳糖昔（IPTG）誘導(dǎo)外源基因表達。不同的表達質(zhì)粒表達方法并不完全相同，因啟動子不同，誘導(dǎo)表達要根據(jù)具體情況而定。
二、原核表達實驗流程
大腸桿菌和酵母蛋白表達系統(tǒng)
中心合成基因（另外收費）或者客戶提供模板(cDNA、基因組DNA、質(zhì)粒等)
構(gòu)建表達載體
篩選陽性克隆
表達優(yōu)化和可溶性分析
SDS-PAGE檢測表達
Western blot檢測表達（可選）
三、注意事項
（1）所有操作盡量在冰上操作，以避免蛋白質(zhì)發(fā)生變性；
（2）根據(jù)自己的需要選擇不同的表達載體，并注意不同的表達載體上的融合標簽和攜帶的抗性基因，其中有些標簽是可以去除的。
（3）構(gòu)建好的載體最好進行測序驗證，保證讀碼框正確，即沒有移碼。
（4）長期保存的pET重組子在高濃度甘油中會導(dǎo)致質(zhì)粒不穩(wěn)定。
（5）37 ℃生長常常會使一些蛋白累積形成包涵體，而30 ℃生長則可能產(chǎn)生可溶的和有活性的蛋白。在某些情況下，低溫（15－20℃）延長誘導(dǎo)時間可以使溶解性蛋白的產(chǎn)量達到最大。
（6）進行SDS-PAGE分析時，需優(yōu)化電泳上樣體積。
（7）制備多（單）克隆抗體的制備，可采用原核表達

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